本文刊登于《中国实用妇科与产科杂志》,37(3):-
DOI：10./j.fk030115
董梦婷，王辰，李会阳，等.基于革兰染色涂片结合临床特征的需氧菌性阴道炎联合诊断标准专家建议［J］.中国实用妇科与产科杂志，,37(3):-.
作者：董梦婷，王辰，李会阳，闫晔，马晓彤，李焕荣，李星烁，王慧慧，张艺旋，齐文慧，孟珂，田文艳，王颖梅，范爱萍，韩姹，薛凤霞
基金项目：国家自然科学基金（）；天津市重大疾病防治科技重大专项（18ZXDBSY）
作者单位：医院妇产科，天津市女性生殖健康与优生重点实验室，天津
通讯作者：薛凤霞，电子信箱：xuefengxia
tmu.edu.cn需氧菌性阴道炎（aerobicvaginitis，AV）是一种以阴道内乳杆菌减少、需氧菌增多为主要特征的阴道炎症，占阴道感染的4.2%～25.8%，易合并其他阴道炎症。AV患者中混合感染占55.0%～76.0%。AV的临床表现主要为外阴阴道烧灼感、*色分泌物、阴道黏膜充血等。AV除可引起患者外阴阴道不适外，还会增加不良妊娠结局和性传播疾病的发生风险，严重危害女性生殖健康。目前，国内外多借鉴Donders等提出的生理盐水湿片法诊断AV，即在×相差显微镜下评估乳杆菌分级（lactobacillarygrades，LBG）、白细胞数、含中*性颗粒的白细胞占比、背景菌落和基底旁细胞（parabasalepitheliocytes，PBC）占比5项指标，每项赋分0～2分，总计10分，≥3分时诊断为AV。该方法有以下几点不足之处：（1）基于生理盐水湿片，未进行染色，放大倍数仅为×。（2）镜下细菌形态较小且可随介质流动，需配备相差显微镜，要求检验人员有丰富的经验。（3）生理盐水湿片无法保存，导致不能够回顾性阅片。因此，其临床推广存在一定局限性。在人工智能与精准医疗的时代背景下，阴道微生态智能化诊断已成为未来的发展趋势。生理盐水湿片因其介质具有流动性，镜下图像动态变化，难以提供同质化、标准化的制片及阅片体系，实现AV的智能化诊断较为困难。此外，AV生理盐水湿片评分法为单纯实验室诊断，所诊断的无症状AV患者可达10%～20%，该部分实验诊断的“患者”是否需要临床干预以及干预是否属于过度治疗，值得商榷。另一种情况是，在临床实践中发现部分患者具有明显阴道炎临床表现，阴道清洁度明显异常，但并不满足生理盐水湿片评分法AV诊断标准。因此，在甄别潜在需要临床干预的患者、指导治疗及判断炎症消退转归方面，生理盐水湿片评分法与临床脱节，其应用也存在一定局限性。革兰染色法是国际实验室检验行业标准推荐使用的细菌形态学基本鉴别方法。相较于生理盐水湿片，阴道分泌物涂片固定后进行革兰染色，细胞及细菌位置固定，可长期保存、重复阅片，仅需普通光学显微镜即可阅片，可在×镜下对大的细胞进行观察、计数，×镜下观察细菌更清晰，能够为阴道微生态智能诊断AV体系的研发提供同质化、标准化的涂片。目前除AV外的常见阴道感染如细菌性阴道病（bacterialvaginosis，BV）、外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginalcandidiasis，VVC）、阴道毛滴虫病均有基于革兰染色涂片的诊断标准。阴道混合感染在阴道炎症中占50%～60%，其中以AV+BV、AV+VVC、BV+VVC最为常见。建立基于革兰染色涂片AV的诊断标准，可实现在同一张涂片上同时诊断上述常见4种阴道炎症及其混合感染，提高诊断效率，具有良好的实用性及可推广价值。本文基于笔者团队对AV的多年研究数据，提出并推荐基于革兰染色涂片结合临床特征的AV联合诊断标准，以期优化AV及其混合感染诊断体系。1革兰染色涂片结合临床特征的AV联合诊断标准取膀胱截石位，将窥器置入阴道内，暴露子宫颈，观察阴道黏膜有无充血，阴道分泌物性状、量及颜色，以2支无菌棉签自阴道上1/3侧壁取分泌物，其中1支用于制作革兰染色涂片，另1支用于检测pH值。普通光学显微镜观察革兰染色涂片。AV联合诊断标准共5项指标，包括：白细胞数（×镜下评估）、PBC占比（×镜下评估）、LBG（×镜下评估）、背景菌落（×镜下评估）和临床特征（阴道pH值、阴道黏膜充血和*色分泌物）。每项指标0～2分，总分10分，≥4分时诊断为AV。4～5分为轻度AV，6～7分为中度AV，8～10分为重度AV。见表1。2制订革兰染色涂片结合临床特征AV联合诊断标准的依据AV联合诊断标准的制订过程包括标准建立和标准验证两部分。自年至今收集研究对象例。首先，回顾性分析年12月至年9月例就诊于医院妇科门诊的AV患者（例）及对照女性（例）的生理盐水湿片、革兰染色涂片的镜检指标及临床特征，对其中例女性阴道分泌物进行16SrRNA基因测序，比较2种方法识别细菌的准确性。通过纳入筛选出的临床特征，建立联合诊断标准。进一步前瞻性收集年1月至年8月于本院妇科门诊行阴道微生态检查者例，验证联合诊断标准的准确性和可靠性。最后形成革兰染色涂片结合临床特征的AV联合诊断标准。2.1AV联合诊断标准的建立联合诊断标准的建立包括显微镜下镜检指标的筛选与确定，临床特征的筛选与确定。
2.1.1革兰染色涂片AV镜检指标的筛选与确定分别对例女性的阴道分泌物生理盐水湿片及革兰染色涂片进行观察，对原生理盐水湿片法诊断AV的5项镜检指标进行配对比较，观察2种方法评估各指标有无差异，以期明确革兰染色涂片能否沿用原生理盐水湿片法的5项镜检指标对AV进行诊断。结果发现，革兰染色涂片（×，普通光学显微镜）评估白细胞数、PBC占比与生理盐水湿片（×，相差显微镜）无差异，但LBG、背景菌落与生理盐水湿片存在差异，并且革兰染色涂片无法显示含中*颗粒的白细胞（表2～3）。进一步配对比较革兰染色涂片（×，普通光学显微镜）与生理盐水湿片（×，相差显微镜）评估的LBG、背景菌落，发现二者无差异（表3）。不同放大倍数革兰染色涂片与生理盐水湿片镜下表现的对比见图1～5。
进一步观察革兰染色涂片与生理盐水湿片评估LBG及背景菌落的准确性。以例女性（80例AV和例健康对照）阴道细菌16SrRNA基因测序结果作为基准，比较生理盐水湿片（×，相差显微镜）和革兰染色涂片（×，普通光学显微镜）镜下评估LBG、背景菌落的准确性。计算样本中相对丰度≥0.1%的菌种及其丰度，按照《伯杰氏细菌鉴定手册（第9版）》对于符合乳杆菌、肠杆菌样小杆菌、球菌样菌形态的菌种进行归类，计算各样本中此3类菌群的相对丰度。按照生理盐水湿片镜检LBG结果将例样本分为0分组（Ⅰ级和Ⅱa级）、1分组（Ⅱb级）与2分组（Ⅲ级），各LBG评分组间乳杆菌相对丰度逐级下降，但1分组（Ⅱb级）与2分组（Ⅲ级）组间差异无统计学意义；根据上述分组法，将例样本按照革兰染色涂片镜检LBG结果同样分为3组，各LBG评分组间乳杆菌相对丰度同样逐级下降，且各组间差异均有统计学意义（见图6a1～a2），提示革兰染色涂片×镜检相较生理盐水湿片×镜检对LBG的判定更准确。按照生理盐水湿片镜检背景菌落结果将例样本分为0分组（无明显杂菌）、1分组（肠杆菌样小杆菌为主）、2分组（球菌样菌为主），0分组和1分组分别以乳杆菌和肠杆菌样小杆菌相对丰度最高，但2分组中，球菌样菌相对丰度未显著增高，差异无统计学意义；根据上述分组法，依据革兰染色涂片镜检背景菌落结果，将例样本同样分为3组，0分组、1分组、2分组分别以乳杆菌、肠杆菌样小杆菌、球菌样菌相对丰度最高（见图6b1～b2）。提示革兰染色涂片×镜检相较生理盐水湿片×镜检对球菌样菌和肠杆菌样小杆菌区分度更高。综合以上结果，采用革兰染色涂片对AV镜下指标进行评估时，使用×光镜观察白细胞数和PBC占比，×油镜观察LBG和背景菌落。为便于联合诊断标准在临床应用中的推广，此4项指标评分仍沿用原生理盐水湿片评分方法的参考值。2.1.2AV临床特征指标的筛选与确定对AV7项常见的临床特征（阴道pH值＞4.5、分泌物增多、瘙痒、烧灼感、性交痛、阴道黏膜充血、阴道*色分泌物）进行筛选。首先，采用单因素及多因素logistic回归分析，结果显示：pH值＞4.5（P=0.，OR=6.，95%CI3.～12.）、阴道黏膜充血（P=0.，OR=5.，95%CI2.～11.）、阴道*色分泌物（P=0.，OR=10.，95%CI2.～35.）为AV的独立相关因素。因此，最终将AV独立相关因素，即pH值＞4.5、阴道黏膜充血、阴道*色分泌物纳入联合诊断标准。
对筛选出的3项临床特征与革兰染色涂片镜检4项指标进行不同排列组合，计算诊断AV的灵敏度、特异度及约登指数，选择约登指数最高的临床特征组合方式，即0分为pH值≤4.5且无异常体征（阴道黏膜充血、*色分泌物），1分为pH值＞4.5或出现任意1项或2项异常体征（阴道黏膜充血、*色分泌物），2分为pH值＞4.5且出现任意1项或2项异常体征（阴道黏膜充血、*色分泌物）。最终建立革兰染色涂片结合临床特征AV联合诊断标准，如表1所示。联合诊断标准各项指标0～2分，总分10分。使用受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic，ROC）曲线计算诊断AV的cut-off值，当≥4分时诊断AV，灵敏度为96.92%，特异度为97.54%，约登指数为0.。使用ROC曲线计算诊断不同严重程度AV的cut-off值，联合诊断标准诊断轻、中、重度AV分别为4～5分、6～7分、8～10分。使用联合标准区分正常及诊断轻、中、重度AV的准确度为84.92%（表4）。2.2AV联合诊断标准的验证为进一步验证AV联合诊断标准的准确性和可靠性，使用PASS15.0统计软件总体率估计样本含量计算，理论验证人群最小样本量为例，前瞻性收集年1月至8月就诊于医院妇科门诊行阴道微生态检查的例女性。对其阴道分泌物分别制作生理盐水湿片及革兰染色涂片2张涂片。使用生理盐水湿片诊断AV及阴道毛滴虫病，革兰染色涂片诊断BV及VVC，最终验证人群包括例阴道微生态正常及阴道微生态失调者，例阴道炎症患者，其中单纯AV53例，单纯BV50例、单纯VVC29例，AV混合感染60例（AV+BV36例、AV+VVC18例、AV+BV+VVC6例），BV+VVC9例，BV+阴道毛滴虫病1例。
由3名具有丰富阴道微生态诊断经验的观察者独立、盲法地对例验证人群的革兰染色涂片和生理盐水湿片AV各项镜下指标进行观察。结果显示，白细胞数和PBC占比在革兰染色涂片中的观察者间一致性与生理盐水湿片相当（KW=0.vs.0.；0.vs.0.）；但LBG、背景菌落在革兰染色涂片评估中的观察者间一致性明显高于生理盐水湿片（0.vs.0.；0.vs.0.），说明革兰染色涂片评估细菌指标可靠性更高。此外，联合诊断标准评估AV评分的一致性也更高（0.vs.0.）（表5）。联合诊断标准诊断单纯AV灵敏度为86.79%，特异度为95.97%，诊断AV及其混合感染的灵敏度为82.30%，特异度为94.83%（表6）。提示AV联合诊断标准在一般人群中诊断AV及其混合感染具有很好的准确性。通过对2种标准诊断结果不一致的情况进行分析，发现：在单纯AV患者中，共7例符合生理盐水湿片标准的单纯AV但未满足联合诊断标准的患者，其中6例为不具有异常临床特征的轻度AV，治疗意义尚需探讨；12例符合AV联合诊断标准但生理盐水湿片漏诊者，其中8例具有阴道黏膜充血、*色分泌物或pH值升高，提示临床需要干预，具有治疗价值。对于AV混合感染，13例符合生理盐水湿片标准但未满足联合诊断标准的AV混合感染患者中，6例为不具有pH升高、*色分泌物或阴道黏膜充血的轻度AV，对于此部分患者是否进行针对AV的治疗，其意义尚需进一步研究。对2种制片方法诊断的89例非AV阴道炎症患者（50例单纯BV、29例单纯VVC、9例BV+VVC、1例BV+阴道毛滴虫病），使用联合诊断标准的革兰染色涂片，均做出了准确诊断，无一例漏诊。此外，在上述患者中，使用同一张革兰染色涂片，还发现其中8例合并AV（其中3例原诊断为BV，合并阴道黏膜充血，应用联合诊断标准诊断为AV+BV；2例原诊断为VVC，合并pH值升高及镜下表现异常，应用联合诊断标准诊断为AV+VVC），提示使用联合诊断标准可在同一涂片诊断AV、BV、VVC等多种阴道炎症及其混合感染，简化临床操作，提高诊断效能。3其他AV诊断方法除已广泛应用的生理盐水湿片评分法用于AV诊断外，国内外还有学者提出其他诊断方法。3.1分子诊断通过实时荧光定量PCR法对阴道内乳杆菌及几种需氧菌设计引物进行半定量检测，当乳杆菌载量减少、需氧菌载量增加时诊断AV。但AV致病菌复杂，仅通过少数几种需氧菌设计引物行PCR法诊断可能存在漏诊，该方法尚处于研究阶段，目前不推荐用于诊断AV。
3.2功能学检测AV诊断相关的功能学指标包括pH值，机体炎性反应标志物，以及针对乳杆菌、需氧菌代谢产物和酶活性变化的生物化学标志物。但值得注意的是，阴道内不同微生物的代谢酶可能产生交叉及干扰，并且功能学检测产品尚缺乏统一的质控标准及诊断一致性评价。故功能学检测不推荐单独用于诊断AV，需联合阴道微生态中的形态学检测。当两者不一致时，以形态学检测结果为准。
3.3生理盐水湿片镜检联合临床特征法美国学者Tempera等提出将临床特征和生理盐水湿片特点相结合的方法，评价内容包括：（1）妇科检查见阴道异常*色分泌物。（2）阴道pH值升高（＞5.0）。（3）分泌物有异味（但KOH试验阴性）。（4）阴道分泌物×镜检（相差显微镜）见大量白细胞。（5）LBG为Ⅱa、Ⅱb或Ⅲ级。该标准在实验室检查的基础上结合了患者的临床表现，但缺乏统一的量化标准，为描述性评价，不易推广，目前临床应用较少。
3.4细菌培养法AV阴道分泌物细菌培养结果复杂，不同国家和地区、不同人种培养结果不尽相同，且健康女性阴道内亦可有需氧菌非致病性定植。此外，传统培养法检出的细菌种类有限、结果等待时间长等局限性，细菌培养及药敏结果可供临床医生抗生素治疗参考，但不推荐作为AV的诊断方法。
4革兰染色涂片结合临床特征的联合诊断标准作为AV诊断标准的优势4.1革兰染色涂片操作简便，对检验设备及检验人员要求低，易推广生理盐水湿片法以无色透明的生理盐水为观察介质，不含染色步骤，主要依靠光线折射率和厚度的不同，对细菌进行辨别，需要专业检验人员在较短时间内对相差显微镜下动态图像进行观察及诊断，对检验人员技术及设备要求高，临床推广困难。
革兰染色作为国际实验室检验行业标准推荐使用的细菌形态学基本鉴别方法，用于阴道炎症的诊断具有以下优势：（1）操作简便。阴道分泌物涂片加热固定后即可染色。（2）制作成本低。染液具有商品化供应途径，性价比高。（3）对检验设备要求低。镜下图像不随介质流动，使用普通光学显微镜即可进行观察，便于图像采集及镜下诊断，并可长期保存、回顾性阅片。（4）细菌识别度高，对检验人员要求低。革兰染色利用不同细菌形态及胞壁成分对染色液亲嗜性不同，而将细菌分为革兰阳性/阴性的杆菌/球菌，在×镜下观察细菌形态，识别度更高，对检验人员要求低。4.2联合诊断标准基于革兰染色涂片识别细菌更清晰，诊断AV准确性高、可靠性好联合标准诊断单纯AV灵敏度为96.92%，特异度为97.54%，提示AV联合诊断标准对于AV诊断具有很好的准确性。同时，鉴于细菌16SrRNA基因序列分析技术可以从分子水平对细菌进行更精准的分类鉴定，在科学研究中作为金标准，用于全面反映微环境中微生物群的复杂构成。所以，在联合标准的显微镜下指标筛选与确定过程中，以细菌16SrRNA基因测序结果作为基准，证实了革兰染色涂片较生理盐水湿片法对于乳杆菌、形态较小的肠杆菌样小杆菌和球菌样菌的区分度更好，对LBG及背景菌落判断的准确度更高。
另外，由于革兰染色涂片细菌、细胞固定，所以镜下指标评判结果不受观察时间限制。在前瞻性验证中，革兰染色涂片对于LBG、背景菌落的判定较生理盐水湿片观察者间一致性更好，且联合标准评估AV评分的一致性也更高，结果更加稳定，可靠性及可重复性优于生理盐水湿片法。4.3联合诊断标准可在同一张革兰染色涂片上同时诊断4种阴道炎症及其混合感染，提高了诊断效能正常情况下，阴道内以乳杆菌为优势菌，同时还寄居着链球菌、加德纳菌等上百种微生物，乳杆菌通过多种机制维持阴道微生态的平衡。当乳杆菌减少和（或）功能异常，需氧菌过度繁殖，可导致AV；厌氧菌过度繁殖，可导致BV；正常定植的真菌由酵母相转为菌丝相可导致VVC。因此，当阴道内环境紊乱时，上述3种阴道感染常易同时发生，导致阴道混合感染。阴道混合感染在阴道感染者中占比可高达56.8%，AV混合感染更常见，常见类型为AV+BV、AV+VVC。
由于阴道混合感染临床表现不典型，其诊断亦较单一阴道炎症困难，且每种阴道炎症的诊断方法不尽相同，常易导致阴道混合感染的漏诊。因此，建立一种能够准确评估阴道感染的诊断体系，对提高混合感染的诊断准确性、明确治疗必要性，进而提高治愈率、降低复发率，维护女性生殖健康十分必要。目前，BV、VVC、阴道毛滴虫病均有基于革兰染色涂片的诊断标准。在既往的临床实践中，同时诊断AV、BV、VVC、阴道毛滴虫病需分别制备生理盐水湿片及革兰染色涂片2张涂片，其中AV需有经验的检验人员在相差显微镜下进行评分与诊断，未配备相应检验设备和检验人员的医疗机构，准确诊断AV十分困难，进而容易导致AV及AV混合感染的漏诊或误诊以及后续的治疗失败。本文提出的革兰染色涂片结合临床特征的AV联合诊断标准，实现了在同一张革兰染色涂片上同时诊断上述常见4种阴道炎症及其混合感染的目的，提高了诊断效能。4.4联合诊断标准结合了临床特征，有效性好，临床实用价值大联合诊断标准加强AV实验室指标与临床特征之间的联系，通过筛选与AV最为相关的临床特征，将pH值＞4.5、阴道*色分泌物及阴道黏膜充血纳入临床特征评分项，最终形成联合诊断标准。通过将革兰染色涂片显微镜下4项指标与临床特征相结合，可从实验室指标及临床两方面对AV进行综合评估。
当阴道内菌群出现失衡或生理盐水湿片法诊断为轻度AV，但无明显临床症状、体征时可能为一过性阴道菌群失调，随着月经周期激素的改变、菌群间的相互作用以及自身免疫能力的调节，上述阴道菌群失调可能会自然恢复，其是否需进行临床干预值得进一步探讨；而一旦患者出现具有典型阴道黏膜充血、阴道分泌物发*或pH值升高的异常临床表现，但生理盐水湿片镜下表现不典型，通过应用本联合诊断标准，对需要临床干预的AV患者具有十分重要的分流意义与临床实用价值。4.5联合诊断标准可推进生殖道感染的人工智能诊断应用联合诊断标准，可使用同一张革兰染色涂片对常见下生殖道感染中AV、BV、VVC及阴道毛滴虫病进行诊断。因革兰染色涂片可长期保存，并可获得同质化、标准化稳定数据，可供研发生殖道感染的人工智能诊断系统；在临床及科学研究过程中，可回顾性阅片；可作为可视化系统和数字化存储媒介用于远程医疗或互联网会诊，医院缺乏相差显微镜及专业检验人员的缺口，医院对女性生殖道感染的整体诊疗能力，促进国家分级诊疗制度的推进。
本团队所构建的革兰染色涂片结合临床特征的AV联合诊断标准，使用普通光学显微镜即可，操作简便，设备及人员要求低，易于普及推广，性价比高，可实现在同一张涂片上同时诊断常见4种阴道炎症，提高了诊断效率，具有良好的实用性及可推广价值。另外，联合诊断标准兼顾了实验室指标与临床特征，准确性高、可靠性好，通过纳入与AV密切相关的临床评分项，使得真正需要临床干预的患者更有可能得到及时诊断和治疗。本诊断标准的提出和应用除了能够优化AV诊断体系外，还为开发人工智能诊断AV的模型奠定了基础。本团队提出的基于革兰染色涂片结合临床特征的需氧菌性阴道炎联合诊断标准的专家建议，旨在为优化AV诊断方案提出指导性建议。当然本建议的提出，更不排除其他诊断方法的合理性，在临床实践中可结合所属地医疗资源和实验室条件选择诊断方法。致谢：医院妇产科张师前教授对本文的审阅；感谢天津医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系马骏教授在本文的统计学方法及数据处理方面给予的宝贵意见。（参考文献略）预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇